Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký HPLC

Hướng dẫn lựa chọn cột sắc ký HPLC

Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký HPLC

Cột sắc ký là ống nhồi chất hấp phụ pha tĩnh nơi xảy ra sự tiếp xúc với mẫu trong dung môi pha động. Các thành phần khác nhau của mẫu tương tác với chất hấp phụ trên pha tĩnh với các lực khác nhau, dẫn tới thời gian ra khỏi cột khác nhau.

Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng bơm áp suất cao đẩy dung môi pha động qua cột, ra đời vào những năm 1960. Ban đầu các cột sắc ký lỏng HPLC có vật liệu pha tĩnh gần như nhau. Cùng với sự phát triển và cải tiến liên tục, hiện tại có hơn 10.000 loại cột sắc ký lỏng HPLC vói pha tĩnh khác nhau từ nhiều nhà sản xuất. Số lượng lớn các loại cột sắc ký lỏng HPLC giúp mang lại lợi thế lớn cho các nhà nghiên cứu, phân tích sắc ký có thể tha hồ lựa chon các cột tách rất cụ thể cho phân tách hầu hết cấc loại mẫu khác nhau. Tuy nhiên số lượng đông đảo các loại cột HPLC cũng khiến người sử dụng bối rối trong vấn đề lựa chọn loại cột phù hợp. Các hướng dẫn chọn mua cột sắc ký HPLC dưới đây sẽ trợ giúp trong việc lựa chọn cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thích hợp.

1. Thân vỏ của cột sắc ký lỏng HPLC:

Hầu hết các cột HPLC đều có cấu tạo thân cột bằng thép không rỉ 316. Ưu điểm là loại thép này là chịu được áp lực và cũng tương đối trơ với các dung môi. Để có hiệu suất phân tách tốt, điều quan trọng là bề mặt bên trong cột phải nhẵn nhụi, không có lỗ nhỏ hay cấu trúc vi mô.

2. Lựa chọn vật liệu nền pha tĩnh:

Nền silica gel:

Hạt silica gel là một vật liệu nhồi cơ bản phổ biến trong các hệ thống HPLC. Nó bao gồm các nguyên tử Si được liên kết bắc cầu bởi các nguyên tử oxy. Một nhược điểm của silica gel là độ pH cao dẫn đến sự hòa tan của nền silica. Cột gel silica có thể được sử dụng trong phạm vi pH từ pH 1 đến 8. Silica gel độ tinh khiết cao với hàm lượng kim loại thấp sẽ làm tăng tính ổn định hóa học của chất nền này. Trên bề mặt, silica gel mang các nhóm silanol (nhóm OH). Các nhóm silanol này có thể được biến đổi hóa học để thu được các pha tĩnh có các đặc tính cụ thể. Ngoài sự ổn định cơ học, silica gel còn có ưu điểm là giá thành thấp. Tương tự như vậy, việc biến đổi bề mặt cũng khá linh hoạt , đơn giản, chi phí không cao. Kích thước lỗ xốp của silica có thể được sản xuất bằng sự phân bố hẹp của silica gel.

Nền polymer:

Các cột HPLC dựa trên nền polymer cũng phù hợp cho sắc ký pha đảo RP-HPLC. Thông thường các polymer polystyrene-divinylbenzene được sử dụng trong cột polymer. So với cột silica gel, Cột nền polymer có tính ổn định với pH cao hơn (giải pH từ 1-13). Cột polymer là sự lựa chọn thú vị cho các phân tách các mẫu đòi hỏi rửa giải bằng các dung môi gradient hỗn hợp, đặt biệt trong sắc ký rây phân tử ( thẩm thấu gel GPC)

3. Lựa chọn cấu trúc của vật liệu nhồi

Hiện có rất nhiều loại hình dạng của vật liệu nhồi. Bên cạnh các pha tĩnh có hạt nhồi có lỗ xốp toàn phần truyền thống, giờ đây còn có thêm các pha tĩnh coreshell, các pha nguyên khối và các pha cho UHPLC với kích thước hạt nhỏ.

Pha tĩnh có lỗ xốp toàn phần

Hầu hết các hạt được sử dụng trong HPLC là các hạt có độ xốp toàn phần (fully porous particle). Kích thước hạt thông thường là 3, 5 μm hay đôi khi cũng lsử dụng hạt 10 μm. Khi các hạt có độ xốp toàn phần, toàn bộ cấu trúc bên trong xốp và có thể so sánh đơn gian giống như một miếng bọt biển.

Pha tĩnh Coreshell:

Các hạt Coreshell có lõi rắn và chỉ có lớp vỏ bên ngoài là xốp. Lõi rắn này dẫn đến hiệu suất tách tăng lên. Các hạt có phân bố kích thước hạt đồng đều hơn và do đó có thể được đóng gói tốt hơn, do giảm thông số khuếch tán xoáy – Hệ số A của phương trình Van Deemter . Ngoài ra, sự truyền khối lượng của các phân tử vào các lỗ xốp (Hệ số C của phương trình Van Deemter  được tăng lên). Một nhược điểm của các hạt coreshell là khả năng chịu tải thấp hơn so với các hạt có lỗ xốp toàn phần.

Hướng dẫn lựa chọn cột sắc ký HPLC - Phương trình Van Deemter
Hướng dẫn lựa chọn cột sắc ký HPLC – Phương trình Van Deemter
  • Phương trình Van Deemter ( Van Deemter equation) mô tả sự ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến hiệu quả tách. Ba hệ số A,B,C của phương trinh liên quan khác nhau tùy thuộc vào bản chất của cột và điều kiện thực nghiệm. Trong đó A là hệ số khuyếch tán xoáy, B là hệ số khuyếch tán dọc theo cột, C là hệ số truyền khối. Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s, C là s). Phương trình Van-Deemter cho thấy sự tồn tại của tốc độ dòng pha động mà tại đó hiệu quả cột là lớn nhất. Hiệu quả cột đạt cao nhất khi H nhỏ nhất, từ điểm đó hiệu quả cột giảm khi tốc độ dòng pha động tăng,

Pha tĩnh đơn khối:

Các cột đơn khối bao gồm một mảnh vật liệu xốp, ví dụ như silica gel hoặc polymer hữu cơ. Do đó, tải trọng sắc ký không bao gồm các hạt riêng lẻ mà là một thanh xốp. Các cột đơn khối có khả năng phân tách tương đương với các cột hạt đóng gói 3 μm. Một nhược điểm cột đơn khối là, đối với các pha đơn  khối, tính khả dụng của độ chọn lọc vẫn khá hạn chế so với các vật liệu xốp toàn phần.

Pha liên kết nhóm chức:

Có rất nhiều nhà sản xuất khác nhau cung cấp đa dạng các loại cột sắc ký liên kết nhóm chức, như pha đảo, pha thường, pha phenyl .. . Điều này làm phát sinh thực tế là không phải lúc nào cũng dễ dàng tìm thấy một cột HPLC phù hợp.

Cột C18 pha đảo rất phổ biến có thể được sử dụng nhiều trong phân tích. Để quyết định pha tính nào phù hợp, bước đầu tiên cần xem xét phân tử đang nghiên cứu. Nếu muốn phân tích một phân tử rất phân cực, có khả năng nó không tương tác với vật liệu C18 và do đó rửa giải trong thời gian lưu chết (dead time). Trong trường hợp này, các pha C4, CN, diol hoặc phenyl là phù hợp. Mặt khác, nếu chất cần phân tích quá không phân cực ví dụ là các mẫu chỉ tan trong heptan hay hexane, nó có thể không tuân theo vật liệu liên kết pha tĩnh và do đó không còn có thể rửa giải khỏi cột. Để tránh điều này, nên sử dụng pha tĩnh silica, CN hoặc NH2.

Hướng dẫn lựa chọn cột sắc ký HPLC - đặc tính pha lien kết nhóm chức
Hướng dẫn lựa chọn cột sắc ký HPLC – đặc tính pha lien kết nhóm chức

Một khi quyết định được việc lựa chọn pha tĩnh, trở ngại đầu tiên được thực hiện. Tuy nhiên, nó càng trở nên phức tạp hơn khi người sử dụng phải quyết định giữa các kích thước và thông số kỹ thuật khác nhau cho cột được sử dụng, chẳng hạn như kích thước hạt, kích thước lỗ xốpg, đường kính trong, đường kính trong hay hàm lượng carbon.

4. Lựa chọn kích thước hạt

Kích thước hạt nhỏ hơn mang lại độ phân giải tốt hơn so với các hạt lớn hơn. Tuy nhiên các hạt kích thước lớn hơn tạo ra áp suất ngược thấp hơn trong hệ thống HPLC. Một phân bố kích thước hạt đồng đều đặc biệt quan trọng ngoài kích thước của hạt. Nếu tăng tỷ lệ các hạt nhỏ làm tăng áp lực, nếu chứa quá nhiều hạt lớn, pha tĩnh sẽ giảm hiệu suất phân tách. Kích thước của hạt có ảnh hưởng đến chất lượng của độ phân giải do kích thước của các hạt ảnh hưởng đến các hệ số A và C của phương trình Van Deemter.

Hiệu suất tách tối ưu đạt được với số đĩa lý thuyết tăng nên trong cột. Đối chiếu trong phương trình Van Deemter, khi các hệ số A và C có thể được giảm thiểu, mang  đến hiệu suất phân tách tốt trong phạm vi lưu lượng lớn

5. Lựa chọn kích thước lỗ xốp

Lỗ xốp càng nhỏ, diện tích bề mặt càng nhiều và khả năng tương tác càng cao dẫn đến khả năng tải cao hơn. Kích thước lỗ xốp sử dụng phụ thuộc vào kích thước của phân tử cần phân tích: phân tử càng lớn thì lỗ xốp càng lớn. Kích thước lỗ xốp thường được tính bằng đơn vị angstroms (Å), tương ứng 10 Å = 1nm. Đối với các phân tử nhỏ, có thể sử dụng một cột với kích thước lỗ xốp 100 -120 Å. Đối với các phân tử sinh học lớn, việc lựa chọn kích thước lỗ xốp phù hợp là đặc biệt quan trọng và các các cột có kích thước lỗ từ 300 Å trở lên thường được sử dụng.

Đặc tính từng loại cột trong phân tích phân tử sinh học:



Khối lượng phân tử g/mol
Kích thước lỗ Å C18 C8 C4
  120 Rất tốt Tốt Thường
> 5000 200 Tốt Rất tốt Tốt
> 20000 300 Thường Tốt Rất tốt

6. Lựa chọn đường kính trong và chiều dài cột

Lựa chọn đường kính trong và độ dài của cột HPLC tùy thuộc vào loại phân tích và thể tích mẫu của mỗi lần phân tích. Ngoài ra tốc độ dòng tối đa của hệ thống thiết bị HPLC đang sử dụng cũng sẽ giới hạn các lựa chọn kích thước cột.

Bảng dưới đây phân loại kích thước cột với tốc độ dòng và thể tích mẫu mỗi lần phân tích:

  ID (mm) Dài (mm) Flow Rate (ml/min) Lượng mẫu(µg)
SK Điều chế > 25 300 hay lớn hơn > 20 > 25000
SK bán điều chế 10 250 hay lớn hơn 5-10 10000-20000
Phân tích thông thường 3; 4; 4.6 50; 100; 150; 250 0.5-2 50-200
Phân tích narrowbone 2; 2.1 50; 100; 150; 250 0.2-0.5 20-100

7. Kết luận

Để chọn mua cột sắc ký HPLC phù hợp, nhiều tham số khác nhau phải được xem xét. Thông thường không có một cột HPLC nào chính xác hoàn toàn với yêu cầu, nhưng luôn luôn có thể tìm đươc khá nhiều cột phù hợp cho mục địch phân tích riêng biệt.

Hy vọng các thông tin ở trên sẽ trợ giúp hướng dẫn chọn mua cột sắc ký HPLC phù hợp. Trong trường hợp bạn vẫn chưa chắc chắn về việc lựa chọn của mình, hãy liên lạc với chúng tôi qua địa chỉ email sales@npsc.vn. Các chuyên gia sản phẩm của chúng tôi và các
các chuyên gia HPLC đầu ngành là cộng các viên của chúng tôi sẽ sẵn lòng tư vấn và cung cấp các trợ giúp cho bạn.

Call Now Button